Для широкой публики этот музей был открыт в 1819 году. Основой для него послужили коллекции картин, которые собирали испанские короли в течение трех столетий. Вначале эти картины предназначались главным образом для украшения дворцовых и церковных капелл. Но в XVI веке (начиная с царствования Карла V) культурные связи Испании с другими европейскими дворами расширяются, и Карл V стал охотно приобретать произведения иностранных мастеров. Его любимым живописцем был Тициан, и в 1548 году он заказывает художнику свой портрет на коне — в память победы под Мюльбергом.

Карл V почти не жил в испанской столице, он предпочитал город Брюссель. Здесь во дворце и хранились приобретенные им коллекции картин Тициана, Моро и других известных живописцев. Впоследствии большинство из этих коллекций было отправлено в Испанию, и теперь они выставлены в Музее Прадо.

Филипп II (сын Карла V), став королем, не покидал Испанию. Он расширил королевские коллекции картин и украсил ими загородный дворец Прадо, перестроенный им для своей третьей жены Елизаветы.

Как и его отец, Филипп II ценил итальянскую живопись и продолжал давать заказы Тициану. Ему нравилась и изощренная художественная фантазия Иеронима Босха, и потому он охотно приобретал его картины. Так в Музее Прадо оказалось лучшее полотно И. Босха «Сад наслаждений».

Главный советник Филиппа IV по приобретению произведений искусства Веласкес приобрел несколько выдающихся произведений Веронезе, Тинторетто, Бассано, и они до сих пор украшают Прадо. Примерно тогда же было куплено много прекрасных картин, и среди них такие шедевры, как «Смерть Богоматери» Монтеньи и «Автопортрет» Альбрехта Дюрера.

В 1628 году в Мадрид с дипломатическим поручением от Нидерландов приезжает великий Рубенс. Роль дипломата не помешала ему заниматься в испанской столице живописью, и написанные им здесь картины сразу же были приобретены испанским королем. Другие произведения Рубенса частью попали в Прадо во время распродажи коллекции после смерти художника («Сад любви», «Три грации» и некоторые другие).

В XVIII веке в Испании большое внимание уделялось развитию естественных наук, и было решено, что первым музеем будет музей будет естествознания. В 1785 году под него отводится место в большом парке Прадо, отсюда впоследствии получил свое название и весь музей. Однако здание для нового музея не было достроено: этому помешали смерть короля Карла III, полное равнодушие к делам культуры Карла IV и последующее нашествие наполеоновской армии.

Только в 1814 году был издан приказ об окончании постройки здания для музея, к этому времени уже сильно пострадавшего от французских войск. Теперь было решено поместить в музей и художественные сокровища, находящиеся во дворцах Мадрида и Аранхуэса.

Вначале в Прадо было совсем немного картин — всего 311. Произведения отбирались для музея с особой тщательностью, совершенно не допускались картины с обнаженными фигурами. Сначала даже было издано специальное постановление сжечь такие картины, но потом их передали в закрытые помещения Академии Сан Фернандо. Постепенно количество картин в Музее Прадо начало возрастать. Значительно обогатило Музей разрешение взять часть картин из Эскориала и монастырей. Со временем Прадо становится все более независимым от королевского двора. В дирекцию Музея, кроме высокопоставленных лиц, входят люди искусства.
 
В 1868 году Прадо из королевского музея превратился в музей Мадрида. В 1927 году в дар Музею дон Сесаро Кабанес принес полотно Эль Греко «Иоанн Евангелист». Некоторые искусствоведы считают его самым привлекательным вариантом образа Иоанна Евангелиста — любимого ученика Христа — в ряде его многочисленных изображений у Эль Греко.

Из других картин Эль Греко в Прадо представлены «Сошествие Святого духа», «Святое семейство», «Крещение», «Вознесение», «Распятие».